掃描電鏡制樣方法｜5種常用的生物樣品干燥方法

掃描電鏡在觀察生物樣品時，具有以下特點：多角度觀察樣品的表面結(jié)構(gòu)；不需要將樣品切成薄片；景深大、圖像立體感強；放大倍數(shù)從幾十倍到幾十萬倍連續(xù)可調(diào)；在觀察形貌的同時可以對微區(qū)的成分進行定量和定性分析。而能否獲得真實、清晰、理想的掃描電鏡觀察結(jié)果，樣品的制備過程是關鍵。

生物樣品含水直接觀察，會對掃描電鏡造成以下影響：

1.  樣品蒸發(fā)的水蒸氣遭遇高能電子束，會被電離而放電，引起束流大幅度波動，使圖像模糊，或者根本不能成像;

2.  大多數(shù)含水樣品在高真空中容易發(fā)生形態(tài)損傷，表面皺縮、變形; 

3.  樣品揮發(fā)會造成鏡頭、光闌等的污染; 

4.  燈絲會被上升水蒸氣氧化而變質(zhì)。

生物樣品的含水量高，二次電子產(chǎn)率低，導電性差，對熱，電子束敏感，僅有少數(shù)樣品如毛發(fā)、牙齒以及含水量極低的昆蟲等可以直接噴鍍觀察，絕大多數(shù)的生物樣品均要求經(jīng)過干燥處理才能鍍金觀察。

干燥是掃描電鏡生物樣品制備中的關鍵環(huán)節(jié)，如果處理不好，會直接影響到觀察的清晰度與準確度。要想制備出好的掃描電鏡生物樣品，需要在干燥過程中盡可能減少由于水分蒸發(fā)而引起的樣品表面形貌的形變，且必須確保干燥。大多數(shù)動植物容易發(fā)生明顯的塌陷和變形。因此，需要針對不同的生物樣品來選擇合適的干燥方法。

掃描電鏡生物樣品制備常用干燥方法

01  自然干燥法

自然干燥法是指樣品中的水分在大氣中自然蒸發(fā)，或樣品經(jīng)脫水處理后脫水劑自然揮發(fā)而干燥的方法。

對干種子、果殼、某些干花粉、昆蟲標本等來說，自然干燥法是一個簡易實用有效的方法，雖然在自然干燥過程中，樣品體積有所收縮，但卻保留了樣品的基本形態(tài)。適用于外表堅硬的樣品，如外表有殼的昆蟲，木材等。

自然風干——飛納掃描電鏡直接觀察螨蟲

02  烘干干燥法 

烘干干燥法是將要研究的樣品用烘干箱烘干，一般溫度控制在 80℃ 以下，烘干程度以含水量在 5% 以下為好。此方法的干燥速度較快，但水分蒸發(fā)時可能造成樣品變形或斷裂。適用于不易變形且耐熱的樣品，比如淀粉粒、孢子粉等。

烘干的花粉噴金后直接可以用二次電子觀察

03  臨界點干燥法

臨界點干燥法是利用物質(zhì)在臨界狀態(tài)下，液體和氣體的密度相等，氣液界面消失，液體的表面張力系數(shù)為零。臨界點干燥法之所以一直被視為制作生物醫(yī)學掃描樣品較可靠的干燥方法，是因為此法能消除液體表面張力的作用，干燥出的樣品能較大程度地保存其自然形態(tài)。

04  冷凍干燥法

冷凍干燥法是將含水樣品放入低溫環(huán)境中冷凍，或使用溶劑將樣品中的水逐級替換后冷凍，然后抽真空升華。它是利用低溫和真空，使樣品中的水分或溶劑直接升華，以達到干燥樣品的目的。冷凍干燥過程不經(jīng)過液相階段，因而避免了氣相和液相之間表面張力對樣品的損傷。

05  真空干燥法

真空干燥法指的是將經(jīng)脫水（多用梯度脫水）的樣品置于真空容器中進行干燥的方法。真空干燥法選用高熔點的有機溶劑（叔丁醇、乙腈、六甲基二硅胺烷、正丁醇等）作升華介質(zhì)，既保留了冷凍干燥法的優(yōu)點，又不用對樣品進行冷凍處理，無冷凍損傷，且操作簡單。適用于所有生物樣品，特別是細菌、細胞等微小樣品。

經(jīng)過梯度脫水真空干燥的桿菌可以輕松獲得高倍圖像

小結(jié)

干燥方法在不斷改進，但還是只能把由干燥引起的樣品變形控制在一定的范圍內(nèi)。上述 5 種干燥方法各有優(yōu)缺點，且各有適用的生物樣品種類。我們在選擇生物樣品干燥的方法時，盡量選擇能保持樣品表面真實結(jié)構(gòu)的方法，在保證掃描電鏡狀態(tài)下，盡量還原樣品表面細節(jié)。

對于生物樣品，飛納電鏡低真空模式可以直接觀察一些生物樣品，如新鮮植物葉片，昆蟲等。觀察葉子氣孔，高亮度的 CeB6 燈絲可以在低曝光時間下快速拍照，獲得高質(zhì)量圖像，避免了長時間曝光導致氣孔關閉以及長時間抽真空導致葉片失水收縮。

飛納電鏡低真空下觀察葉子氣孔

此外，飛納電鏡的專用控溫樣品杯可以控制樣品溫度，進而改變樣品周圍的濕度，最大限度地降低電子束和真空度對樣品的損壞。適用于一些含水較高的水凝膠，蛋白，藻類等樣品，在冷凍狀態(tài)下，不脫水，背散射直接觀察，可以保持樣品的原始形貌結(jié)構(gòu)。

冷凍的水凝膠，觀察到其大范圍內(nèi)，短程有序，長程無序